曹蕾 马扬光 施小明
【摘 要】 介绍了荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程，总结了其日常维护和注意事项，为其使用提供指导。
【关键词】 荧光定量PCR仪 操作规程 维护
荧光定量PCR仪将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。
1 原理介绍
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。
荧光染料法：荧光染料能特异性掺人DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步[1]。
荧光探针法：探针的5 端标记荧光报告基团 （reporter R） 3 端标记淬灭基团（quencher Q），探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步[1] [2]。
通常，荧光擴增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为ct值。模板的ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数[3]。
2 操作规程
2.1 开机
2.1.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。
2.1.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。
2.1.3 点击SDS软件。
2.2 检测
2.2.1 选择File-New-新建，在New Document Wizard窗口中，从Assay下拉列表中选择反应类型：相对定量，绝对定量，等位基因鉴别或阳性阴性实验，从Container下拉列表中选择反应板类型，在Default Plate Name中输入反应板文件名，点击Next，选择需要添加到反应板文件的探针，点击Next，为每个孔指定探针和任务，单击Finish。
2.2.2 在Well Inspector-View-Well Inspector中输入样品名。
2.2.3 运行相应的反应类型程序，选择Instrument设定PCR条件。
2.2.4 点击Save下拉菜单下的Save As，输入文件名，点击save，关闭设置界面。
2.2.5 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测反应板放入检测孔位，再次按压托盘使其滑入仪器，点击Start开始检测。
2.3 结果分析
PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析，选择Analysis-Analysis Settings 选择Auto Ct，软件自动为每个反应空生成基线和阈值，也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值，Threshold值，点击Analyze进行再次分析。
2.4 关机
实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑
3 日常清洁维护[4]
3.1 每周用无绒布块蘸取75%酒精清洁仪器的表面。
3.2 每周使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。
3.3 每月执行一次背景校准
3.4 每半年检查灯具状态。在7500 Software中，选择Instrument-Lamp Status/Replacement以确定卤素灯的状态：Condition显示 Good 表示灯具工作良好，不需更换卤素灯；显示Failed表示卤素灯已坏，需更换； Change Soon表示灯具使用超过2000小时，建议将更换。
3.5在PCR仪运行之前或期间，7500 Software可能显示警告，按警告要求进行目标区（ROI）校正、背景校准、光学校准、染料校准、RNase P仪器验证试验等。
参考文献
[1] 钟江华，张光萍，柳小英.实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用[J].氨基酸和生物资源，2011，33（2）：68～72.
[2] 兰静，李秋根.实时荧光定量PCR技术理论研究及其在医学方面的应用[J].南昌大学学报（医学版），2011，51（10）：97～100.
[3] 王志平.荧光定量PCR技术的原理与应用[J].渭南师范学院学报，2012，27（10）：61～64.
[4] 魏建新. ABI7500 型荧光定量PCR仪的使用维护及故障排除[J]. 中国卫生检验杂志， 2015，25（21）：3780～3781.
